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    公开号:WO1991013976A1
    申请号:PCT/JP1991/000319
    申请日:1991-03-08
    公开日:1991-09-19
    发明作者:Yasushi Kawauchi；Koji Kawamura；Yoriko Suzuki；Tetuo Morinaga；Kiyoshi Furuichi
    申请人:Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 精製 T Ρ Αおよびその誘導体の製造方法 技術分野
    [0003] 本発明は、 精製組織型プラスミノーゲンァクチベータ （以下、 組 織型プラスミノーゲンァクチベータを T P Aと略す） またはその誘 導体の製造方法に関する。
    [0004] 更に詳しくは、 本発明は T P Aまたはその誘導体含有液を最初に ァフィ二ティーク口マトグラフィ一工程で処理し、 その後任意の順 序で疎水クロマトグラフィ一工程、 陽イオン交換クロマトグラフィ 一工程および必要により、 陰イオン交換クロマトグラフィ一工程に より処理することを特徵とする精製 T P Aまたはその誘導体の製造 法及び T P Aまたはその誘導体含有液を、 クロマトグラフィ一ゲル として、 セルロース硫酸エステルまたは、 架橋ポリサッカライ ド硫 酸エステルのゲルで処理することを特徴とする精製 T P Aまたはそ の誘導体の製造方法である。 背景技術
    [0005] ヒ ト T P Aおよびその誘導体は、 静脈および動脈血栓を溶解する ことがわかっており、 大規模な臨床試験の報告では静脈内投与した T P Aが急性心筋梗塞の患者における閉塞冠動脈の再灌流をもたら すのに有効であることが示されている。
    [0006] T P Aまたはその誘導体の精製に関連する技術としては、 欧州 特許出願公開第 号明細書に記載されている。 これには、 亜 鉛キレー ト Sepha roseR 、 コンカナパリ ン A— Aga ros eR および SephadexR G-150 が用いられる。 これら精製工程にはそれぞれ大き な欠点が伴う。 すなわち.、 亜鉛およびコンカナパリ ン Aは生成物に 混入する可能性があり、 また SephadexR G - 150 は、 その能力およ び流動性の故に工業的製造方法に用いるには難点がある。 欧州特許 出願公開第 23869 号明細書には、 フイ ブリンの可溶性断片が共有結 合により固定化される担体を用いた T P Aの精製方法が記載されて いる。 この方法も同様に工業的製造方法には適していない。 ' また、 最近、 T P Aに対して特異性を有する、 モノクローナル抗 体の調整法およびその分離、 精製法 （特開昭 - 2 Π 1 Π号公報） が 開発されたことから免疫吸着ァフィ二ティクロマトグラフィ一を利 用して、 上記 T P Aを分離、 精製する方法が開発された。 しかしな がら、 上記精製法では多くの時間を要し、 モノクローナル抗体が生 成物に混入するおそれもあり、 また精製 T P Aの回収率も約 40— 50 %で低いという難点がある。 従って、 この精製法は、 研究規模には 利用し得るものの、 大規模な精製 T P Aの製造法には適さない。
    [0007] さらに以上述べた精製方法により得られる T P Aの純度は、 医薬 品として用いる際必ずしも十分といえない。 発明の開示
    [0008] 本発明者等はカラムクロマトグラフィ一法又はバッチ法を用いて より高純度に、 より高収率に、 より簡単に、 より安価に精製 T P A またはその誘導体を製造する方法を見出すべく種々研究を重ねた結 果、 T P Aまたはその誘導体含有液を、 最初にァフィ二ティ一クロ マトダラフィ一工程で処理し、 その後任意の順序で疎水クロマトグ ラフィ一工程、 陽イオンクロマトグラフィ一工程、 および必要によ り陰イオン交換ク口マトグラフィ一工程により処理することにより 不純物を含有する T P Aまたはその誘導体培養液から、 比較的短時 間で高収率、 且つ極めて高い精製度で、 しかも簡単に目的とする精 製 T P Aまたはその誘導体が得られることを知り本発明を完成した c また、 本発明者等は最初のァフィ二ティークロマトグラフィーェ 程において、 クロマトグラフィ一ゲルとしてのセルロース硫酸エス テルまたは架橋ポリサッカライ ド硫酸エステルのゲルが T P Aまた はその誘導体と特異的に親和性を有することを見いだし、 この知見 にもとづいて、 これら硫酸エステル類のゲルを用いて、 T P Aまた はその誘導体を含む培養液を精製処理することにより、 比較的短時 間に極めて高い精製度かつ高収率で、 しかも、 極めて簡単に目的と する精製 T P Aまたはその誘導体が得られることを知り、 本発明を 完成するに至った。
    [0009] すなわち、 本発明は T P Aまたはその誘導体含有液を最初にァフ ィニテイ ク口マトグラフィ一工程で処理し、 その後任意の順序で疎 水クロマトグラフィ一工程、 陽イオン交換クロマトグラフィ一工程、 および必要により陰イオン交換クロマトグラフィ一工程により処理 することを特徵とする精製 T P Aまたはその誘導体の製造方法また は最初のァフィ二ティ一クロマトグラフィー工程において、 クロマ トグラフィ一ゲルとしてのセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリ サッカライ ド硫酸エステルのゲルで処理することを特徴とする精製
    [0010] T P Aまたはその誘導体の製造方法である。
    [0011] 本発明によって精製可能な T P Aまたはその誘導体としては、 例 えば、 特公昭 62- 16931号公報に記載された天然型 TP A、 あるいは、 国際公開第 89/03874号パンフレツ ト （1989) 、 特開昭 62-48378号公 報、 特開昭 62- 577号公報、 国際公開第 89/00197号パンフレツ ト ( 1989) もしくは Kagi tani. H. et al. FEBS Letters, vol.189,
    [0012] Pl 45, (1985)等に記載された組換え型 T P A誘導体等が挙げられる。 また、 本発明で用いられるセルロース硫酸エステルとしては、 セ ルロースを硫酸エステル化して得られるのである力 好ましくは結 晶セルロースあるいは、 結晶領域および非結晶領域からなるセル口 ースを硫酸エステル化したものが良い。 この場合、 得られたセル口 —ス硫酸エステルは元の形状を保持し、 物理的安定性に優れ、 クロ マトグラフィ 一用ゲルまたは吸着用ゲルとして好適である。 これら の原料セルロース類としては、 例えば、 セル口ファイン GC- 15 、 同 GH-25 、 同 GC- 100、 同 GC- 200 (チッソ社製） 、 アビセル （旭化成ェ 業社製） などがある。 これらのゲルを例えばピリ ジンなどの有機溶 媒の存在下、 クロルスルホン酸、 無水硫酸などを作用させることに より所望のセルロース硫酸エステルが得られる。 さらに、 これらの セルロース硫酸エステルとしては、 例えば、 硫酸化セル口ファイン
    [0013] (生化学工業社製） がある。
    [0014] 架橋ポリサッカライ ド硫酸エステルとしては、 デキストラン、 セ ル口ース類、 ァガロースなどのポリサッカライ ドを、 例えば、 ェピ クロルヒ ドリ ン、 ジクロルヒ ドリ ン、 ジブロムヒ ドリ ン、 エチレン ダリコールビスエポキシプロピルエーテル等の架橋剤で架橋して得 られる架橋ポリサッカライ ドを硫酸エステル化して得られるもので ある。 この架橋ポリサッカライ ドとしては、 例えば、 架橋デキスト ランとしてセフアデックス G-10、 G-25、 G- 50、 G-100 (フアルマシ ァ社製） 等があり、 架橋ァガロースとして、 セファロ一ス Cい 2B 、 CL-4B 、 CL-6B (フアルマシア社製） 等があり、 架橋セルロースと して、 セル口ファイン GCい 25、 GCL-90 (チッソ社製） 等がある。 こ れらのゲルを例えば、 ピリジン等の有機溶媒の存在下、 クロルスル ホン酸、 無水硫酸等を作用させることにより所望の架橋ポリサッカ ライ ド硫酸エステルが得られる。
    [0015] 次に疎水ク口マトグラフィー用ゲルとしては、 例えば TSKgel ETHER-5PW (東ソ一社製） 、 TSKgel Phenyl-5P (東ソ一社製） 、 TSKgel Butyl-NPR (東ソ一社製) 、 Shim-pack HPC-C2 (島津製作所 社製） 、 Shim-paek HPC-C3 (島津製作所社製） 等があり、 陽イオン 交換クロマトグラフィー用ゲルとしては、 例えば TSKgel CM-5PW (東ソ一社製） TSKgel SP-2SW (東ソ一社製） 、 TSKgel SCX (東ソ 一社製） 、 Shim- pa PA- SP (島津製作所社製） 、 TSKgel C -2S (東ソ一社製） 、 Shim- pack PA- CM (島津製作所社製） 等が、 陰ィ オン交換クロマトグラフィー用ゲルとしては、 TSKgel QAE-2SW, TSKgel DEAE-NPR (東ソ一社製) 、 PL- SAX (POLYMER LABORATORIES 社製） 等が挙げられる。
    [0016] 本発明の精製 T P Aまたはその誘導体の製造方法の各工程の実施 は通常のカラムクロマトグラフィー法、 高速液体クロマトグラフィ 一法あるいはバッチ法等で採用される操作が適用されるが、 好まし い実施態様は以下の如くである。
    [0017] 1) 第 1工程
    [0018] 本発明製造法の第 1工程では、 例えば硫酸化セル口ファインを クロマトグラフィーゲルとして用い、 このゲルを適当な緩衝液、 例えば G.1 重量％の Tween 80を含む Q.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 (pH6.0)で平衡化したのち、 カラムに TP Aまたはその誘導体を 吸着させ、 蒸留精製水、 0.1 重量％の Tween 80を含む 50mMトリス 一塩酸緩衝液 （pH7.4)、 0.1 重量％OTween 80を含む 0.25M塩化 ナトリゥム含有 5QniMトリスー塩酸緩衝液 （pH7.4)、 0.1 重量％の Tween 80を含む 0.25M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)にて洗浄 することにより行なう。
    [0019] このあと、 イオン強度が平衡化に用いた緩衝液イオンのイオン 強度よりも大である適当な緩衝液、 例えば、 1.25M塩化ナトリウ ム、 0.1 重量％の Tween 80および 0.2Mアルギニンを含む 50mMトリ スー塩酸緩衝液 （pH7.4)、 さらに 0.1 重量％の 6611 80および 2 M塩化ナトリゥムを含む 50mMトリスー塩酸緩衝液 （pH7.4)にて溶 出することにより、 精製された T P Aまたはその誘導体が得られ る。
    [0020] 2) 第 2工程
    [0021] 本発明製造法において第 2工程として特に疎水ク口マトグ.ラフ ィ 一工程を実施するのが好適である。 即ち、 第 2工程は、 たとえ ば TSKgel ETHER- 5PWを用いたクロマトグラフィーにより、 ゲルを 適当な緩衝液、 例えば 0. 硫酸ァンモニゥムおよび 0.3M塩化ナト リゥムを含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH5.0)で平衡化した のち、 第 1工程の硫酸化セルロフアインからの溶出活性画分を上 記平衡化に用いた緩衝液と同様の塩濃度に希釈したのちカラムに 吸着させることにより行なう。
    [0022] 次に 3M硫酸アンモニゥムを含む 0.1M齚酸アンモニゥム緩衝液
    [0023] (pH5.0)と 0.1 重量％の1¥ 11 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝 液 （ρΗ5· 0)とを用い、 リニアグラジヱントにかけて分離し、 ΤΡΑ およびその誘導体の活性画分を得る。
    [0024] 3) 第 3工程
    [0025] 本製造法の第 3工程は、 陽イオン交換クロマトグラフィー工程 を実施するのが好適である。 本工程は例えば TSKgel CM-5PW を用 いたクロマトグラフィ一によりゲルを適当な緩衝液、 例えば 0.1 重量％0Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)で 平衡化したのち、 第 2工程の活性溶出画分を上記平衡化に用いた 緩衝液で希釈したのちカラムに吸着させることにより行なう。 次に、 0.1 重量％の1 611 80を含む Q.1M酢酸アンモニゥム緩衝 液 （pH6.0)と 0.1 重量％の 11 80および 2 M塩化ナトリウムを 含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)とを、 リニアグラジヱ ントにかけて分離し、 T P Aまたはその誘導体の活性画分を得る c この TSKgel CM-5PW を用いたクロマトグラフィ一を再度繰り返す ことにより、 高度に精製された活性画分を得ることができる。 本 発明の精製法によれば、 非常に簡単に、 高純度で且つ高収率で目 的とする精製 TP Aまたはその誘導体が得られる。
    [0026] なお、 この第 3工程においては、 陽イオン交換クロマトグラフ ィ一を実施する前に陰イオン交換'クロマトグラフィ一工程で第 2 工程の活性画分を精製したのち、 陽イオン交換クロマトグラフィ 一工程を実施することもできる。
    [0027] この場合は、 陰イオンクロマトグラフィーとして例えば、 Pい SAX を用い、 このゲルを例えば適当な緩衝液、 例えば 0.1 重量％ . T een80 を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)で平衡化し たのち、 第 2工程で得られた溶出活性画分を上記平衡化に用いた 緩衝液で希釈したのち、 カラムに素通しさせ、 さらに同じ緩衝液 を用い洗浄させ溶出液を得ることができる。
    [0028] なお、 本発明の製造法に使用される T P Aまたはその誘導体含 有液にァプロチニンのようなセリンプロテア一ゼインヒビタ一を 添加すると、 T P Aの酵素的分解を阻止することができる。 図面の簡単な説明
    [0029] 第 1図は実施例 1の各精製段階でのサンプルの SDS-ポリアク リル アミ ドゲル電気泳動パターンを示す。 図中、 レーン①は分子量サイ ズマーカ一、 レーン②は硫酸化セル口ファインによる精製サンプル, レーン③は TSKg e l ETHER- 5 PWによる精製サンプル、 レーン④は
    [0030] TSKg e l CM-5PW で 1回処理した後の精製サンプルおよびレーン⑤は TSKg e l CM- 5P で 2回処理した後の精製サンプルを示す。
    [0031] 第 2図は、 実施例 2における各精製段階でのサンプルの SDS-ポリ アク リルアミ ドゲル電気泳動パターンを示す。
    [0032] 第 3図は、 実施例 3における各精製段階でのサンプルの SDS-ポリ アク リルアミ ドゲル電気泳動パターンを示す。 産業上の利用性
    [0033] 本発明の製造方法は工業的規模においても簡単な操作で行なうこ とができるうえ、 特別の高価な試薬も必要とせず、 極めて安価に T P Aまたはその誘導体の工業的精製をおこなうことができ、 しかも 得られる製品には従来法におけるような抗原抗体反応物等の不純物 が混入する恐れのない利点を有する。
    [0034] 本発明の精製 T P Aまたはその誘導体は、 直接医薬品として使用 できる程度の高純度のものであるから、 本発明は実用上極めて有用 である。
    [0035] 更に本発明製造法の第 1工程で用いられるゲルのうち、 特にセル ロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライ ド硫酸エステルはセ ルロースまたは架橋ポリサッカライ ドのマトリ ックスに直接スルホ ン基が結合しており、 このためスルホン基含量も高いため、 T P A またはその誘導体の特異的吸着能に優れており、 培養液から T P A またはその誘導体以外のタンパク 〔例えば、 牛血清アルブミ ン （B S A) 〕 等の除去に特に有効である。 また、 そのゲル自体の安定性 にも優れており、 大量の培養液も迅速に処理できる。
    [0036] また、 本発明の精製法は、 カラムクロマトグラフィ一のみならず バッチ法にも同様に適用でき、 工業的規模においても簡単な操作で 行ないうるうえ、 特別の高価な試薬も必要とせず、 極めて安価に精 製 T P Aまたはその誘導体を製造することができる。
    [0037] 本発明の精製 T P Aまたはその誘導体の製造方法は、 天然組織型 プラスミノーゲンァクチベータはもとより、 遺伝子組換技術を利用 した組換体の誘導体にも適応できるものであり、 極めて汎用性の優 れた製造方法である。 実施例
    [0038] 以下、 実施例により、 本発明をさらに具体的に説明する。 実施例 1
    [0039] 改良型 T P A 〔VI〕 の精製
    [0040] 1) 硫酸化セルロファィンを用いたァフィ二ティ クロマトグラフィ 硫酸化セル口ファインゲル （生化学工業社製） をカラム （バイ ォプロセスカラム ； カラムサイズ、 径 lUramX 450腿 ； フアルマ シァ L K B社製） に充填し、 タンパク分離システム （綜研化学社 製） に接続し、 これに 0.1 重量％の 6611 80を含む 0. 1M酢酸アン モニゥム緩衝液 （pH6.0)を流速 90ralZ分で 45分間通液し平衡化し た。
    [0041] 改良型 T P A (国際公開第 89/03874号パンフレツ ト （1989) に記 载されている、 改良型い PA[V 培養液 1881を pH6.0 に調整後、 こ のカラムに流速 80ml/分で通液した。 この後に蒸留精製水を用い て流速 50Π11Ζ分で Π時間洗浄する。 次いで、 0.1 重量％の 6611 80を含む 50mMトリスー塩酸緩衝液 （pH7. を流速 MmlZ分で 90分 間通液し、 次いで、 0.1 重量％0Tween 80および 0.25 塩化ナト リゥムを含有する トリス一塩酸緩衝液 （PH7.4)を用いて、 流速
    [0042] 90ml/分で 75分間通液し、 次いで、 0.1 重量％0Tween 80を含む 0.25M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)を流速 90ml/分で 45分間 通液する。
    [0043] その後、 先ず 0.1 重量％の 6611 80、 1.25M塩化ナトリゥムぉ よび 0.2Mアルギニンを含むトリスー塩酸緩衝液 （ρΗ7.4)を流速 90 ml/分で 25分間通液し活性画分を溶出し、 さらに 0.1 重量％の Tween 80および 2 M塩化ナトリゥムを含むトリスー塩酸緩衝液 (pH7.4)を流速!) OinlZ分で 60分間通液し、 各分画を SDS-ポリアク リルアミ ド電気泳動および銀染色 （第一化学社製） によるバンド の位置、 TPA-EL1SA (後記の特開平 2- 号公報の実施例 5を改 良した T P A抗原量測定法） による抗原値、 さらにはフイ ブリ ン /ァガロース平板法 （国際公開第 89/03Π4号パンフレツ ト （ 1989: 公報に記載されている方法） による活性値より、 その目的とする 改良型 T P Aを含む分画を得た。 ) TSKgel ETHER-5PWを用いた疎水クロマトグラフィー
    [0044] TSKgel ETHER- 5PWゲルを充填したカラム （カラムサイズ径 55腿 X 200 腿 ；東ソ一社製） を綜研化学社製タンパク分離システムに 接続したのち、 0.8M硫酸アンモニゥムおよび 0.3M塩化ナトリウム を含む 0. U1酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH5.0)を流速 40m IZ分で 30 分間通液し平衡化した。
    [0045] 前記の 1)の硫酸化セルロフアインを用いたクロマトグラフィー の溶出活性画分 2016mlを最終濃度で硫酸アンモニゥム Q.8M、 塩化 0 ナトリウム になるように希釈した後、 カラムに流速 40m 1Z分 で吸着させる。
    [0046] 3M硫酸アンモニゥムを含む 0.1M齚酸アンモニゥム緩衝液 （pH
    [0047] 5.0)および 0.1 重量％の1^611 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩 衝液 （pH5.0)を用い、 リニアグラジェントをかけ、 その活性画分 を溶出させた。 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動および銀染 色によるバンドの位置、 TPA- EL1SA (前記） による抗原値、 さら にはフイブリンプレート法による活性値より、 その目的とする改 良型 T P Aを含む分画を得た。 ) TSKgel CK-5PW を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー
    [0048] TSKgel CK-5PW ゲルを充填したカラム （カラムサイズ径 55mmX 200 丽；東ソ一社製） を綜研化学社製タンパク分離システムを用 い、 0.1 重量％の Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 (pH6.0)を流速 δΟπιΙΖ分で 30分間通液し平衡化した。
    [0049] 前記の 2)の溶出活性画分 666ml に 1M リン酸アルギニン溶液 (リ ン酸 ml、 L—アルギニン Π4.2g、 10重量％の丁 £11 80を ltnU 蒸留精製水を加えて 1リッ トルにしたもの） 166ml 、 0.1 重量％の了 ^611 を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0) 7488mlを加えたのち、 流速 60ml/分で吸着させた。
    [0050] 0.1 重量％の 6611 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH
    [0051] 6.0)と 0.1 重量％の了¥ 11 80および 2M塩化ナトリゥムを含む
    [0052] 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液を用い、 リニアグラジヱントをかけ、 その活性画分を得る。 溶出活性画分を用い SDS-ポリアク リルァミ ドゲル電気泳動および銀染色によるバンドの位置、 TPA- EL1SA (前記） による抗原値、 さらにはフイブリンプレート法 （前記） による活性値より、 その目的とする改良型 T P Aを含む分画を得 た。
    [0053] さらにこの活性画分を上に記した TSKgel CM-5PW を用いたクラ マトグラフィーを同様に再度行い、 より精製された活性画分を得 ナ:。
    [0054] この得られた分画を集め、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳 動および銀染色にかけると、 改良型 T P Aが単一バンドとして検 出された。 ) 結果
    [0055] 改良型 T P A 改良型 T P A
    [0056] 抗原量 （mg) 回収率 （％)
    [0057] 培養液 1011 100
    [0058] TSKgel CM-5PW
    [0059] (一回目） 355 35
    [0060] (二回目） 287 28
    [0061] 特開平 2_492号公報の実施例 5を改良した T P A抗原量測定法
    [0062] 96穴平底マイクロプレートの各ゥヱルに 0.05M炭酸ナトリウム (pH9.6)に 1 Znilで溶解したモノク口一ナル抗体 SP- 322を 100 //1ずつ添加する。 4°Cで一晩インキュベートした後、 溶液を捨て、 1 %BSA を含む lOmMトリス緩衝食塩液 （T B S ： 10mMト リス塩酸、 塩化ナトリウム 9 gZl、 pH7.5)を 200//1添加し、 室温で 1〜 3 時間静置し、 各ゥニルの未吸着分をブロックする。
    [0063] その後、 0.05重量％の 6611 20を含む TB S (TBS/Tveen)溶液 で数分間、 数回洗浄する。 TP Aあるいは検体 0.2% BSA を含む TBS/Tween (BSA/TBS/Twe en) 溶液で希釈し、 ΟμΙずつ各ゥュル に添加し、 室温で 3時間または 4 °Cで一晚反応をおこなう。
    [0064] 先と同様に TBS/Tween 溶液で 1 /; gに希釈した西洋ヮサビバーオ キシダーゼ標識ャギ抗ヒ トメラノーマ TP A抗体 （ Bicpool社製） を添加し、 室温で 3時間反応をおこなう。 反応後、 TBS/Tween 溶 液で洗浄し、 酵素基質として、 0.02%過酸化水素、 並びに 0. lmg /ml の 3、 3、 5、 5—テトラメチルベンジジンを含む 0 M酢酸 —クェン酸ナトリゥム緩衝液 （pH5. 8)を 100/ilずつ添加し、 室温 で 15分間ィンキュベ一トを行なう。
    [0065] インキュベート後、 3Μ 硫酸を 25/ilずつ加え反応を停止し、 405 nm の吸光度を測定する。 各濃度の T P A ( 0. 078 ng 〜5 ng/m 1)を用い検量線を作成し、 各検体中の改良型 T P Aの濃度を求め な 実施例 2. 改良型 T P A [V I ] の精製
    [0066] 1) 硫酸化セル口ファインを用いたァフィ二テイ ク口マトグラフィ 硫酸化セル口ファインゲル （生化学工業社製） をカラム
    [0067] (Superi lo column ； カラムサイズ 50ml ； Sepragen社製） に充填 し、 東ソ一社製 H P L Cシステムに接続し、 これに溶液 1一 A [0. 1 重量％ Tween 80を含む 0. 1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH 6. 0)] を流速 15ml/分で 500ml 通液し平衡化する。
    [0068] 改良型 T P A [V I ] (国際公開第 Π/03Π4号パンフレッ ト ( 1989) に記載されている） 培養液 200 1を pH6. 0 に調整後、 こ のカラムに流速 15mlZ分で通液する。 この後に上記溶液 1一 Aを Π50ιη1通液し流速 15mlZ分で洗浄する。 次いで、 溶液 1一 Aと溶 液 1 — B [1. 0M塩化ナトリゥムおよび 0. 1重量％ Tween 80を含 む 0. 1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6. d)] とを用い、 流速 15mlZ 分で 50分間に溶液 1— Bの 0〜 100%のリ二アグラジヱントをか け、 その活性画分を溶出させ、 各分画を SDS-ポリアクリルアミ ド 電気泳動および銀染色 （第 1化学社製） によるバンドの位置、
    [0069] TPA-ELISA (特開平 2- 492 、 実施例 5を改良し用いる による 抗原値、 さらにはフイ ブリ ン Zァガロース平板法 （国際公開第 89 /0Π74号パンフレッ トに記載されている） による活性値より、 そ の目的とする改良型 T P A [V I ] を含む分画 300mlを得る。 3 ) TSKgel ETHER-5PWを用いた疎水クロマトグラフィー
    [0070] TSKgel ETHER-5PWゲルを充填したカラム （カラムサイズ 07.5x 75雇；東ソ一社製） を島津製作所社製 H PL Cシステムに接続し たのち、 溶液 2— A [1.5M硫酸アンモニゥムを含む 0.1M酢酸アン モニゥム緩衝液 （pH5.0)] を流速 2ml/分で 30分間通液し平衡化 する。 前記 1) の硫酸化セル口ファインを用いたクロマトグラフ ィ一の溶出活性画分 150ml (前記 1で得られた半量） に、 300ml の溶液 2— Aを加え混ぜ合わした後、 カラムに流速 2mlZ分で吸 着させる。
    [0071] 溶液 2— Aで同流速でさらに 60分間洗浄する。 溶液 2— Aと溶 液 2— B [0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸ァンモニゥム緩衝 液 （pH5.0)とを用い、 流速 linlZ分で 60分間の溶液 2— Bが 0〜 100 %までのリニアグラジェントをかけ、 その活性画分を溶出さ せる。 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動および銀染色による バン ドの位置、 TPA-EL1SA (前記） による抗原値、 さらにはフィ ブリ ンプレート法による活性値より、 その目的とする改良型 TP A [V I] を含む分画 12mlを得る。 ) Pい SAXを用いた陰イオン交換ク口マトグラフィ 一
    [0072] Pい SAXゲルを充填したカラム （カラムサイズ 04.6x 150誦 ；
    [0073] 20/im, 1000 A ； POLYMER LABOMTOR 1 ES社製) を島津製作所社製 H P L Cシステムに接続したのち、 溶液 3— 1 [0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)] を流速 1.0ml/ 分で 30分間通液し平衡化する。 前記 2)の TSKgel ETHER- 5PWを用い たクロマトグラフィーの溶出活性画分 6ml (前記 2) で得られ た半量） に、 5 1の溶液 3— Aを加え混ぜ合わした後、 カラム流 速 1.0ml Z分でカラムに素通しさせた後、 さらに溶液 3— A 25 mlで洗浄後、 85mlの溶出液を得る。
    [0074] 尚、 この使用したカラムは、 溶液 3— B [1M塩化ナ卜リウム 4 および 0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 (pH6.0 ) で洗浄し再使用することができる。 TSKgel CM- 5PW を用いた陽イオン交換クロマ トグラフィー
    [0075] TSKgel CM- 5PW ゲルを充填したカラム （カラムサイズ 07.5x75 腿 ；東ソ—社製） を島津製作所社製 HP L Cシステムを用い、 溶 液 4— A [0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝 液 （pH6.0)] を流速 2mlZ分で 30分間通液し平衡化する。 前記 3)の Pい SAXを用いたクロマトグラフィ一の溶出活性画分 85mlを流 速 SmlZ分で吸着させる。 溶液 4一 Aで同流速で 60分間洗浄する c 溶液 4— Aと溶液 4一 B [L 0M塩化ナトリウムおよび 0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)] とを用い、 流速 1 m 1/分で 60分間の溶液 4一 Bが 0〜 1 (10%までのリニアグ ラジェントをかけ、 その活性画分を得る。 溶出活性画分を用い SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動および銀染色にかけ、 その パン ドの位置、 TPA-EL1SA (前記） による抗原値、 さらにはフィ ブリ ンプレート法 （前記） による活性値より、 その目的とする改 良型 TP A [V I] を含む分画 8mlを得る。 この得られた分画を 集め、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動および銀染色にかけ ると、 改良型 T P A [V I] が単一バンドとして検出される。
    [0076] 5 ) 結果
    [0077] 試料 改良型 T P A [V I] *'
    [0078] 抗原量 （/ig) 回収率 （％)
    [0079] 培養液 2220 100
    [0080] TSKgel CM-5PW 918 41
    [0081] (最終精製物）
    [0082] 比活性
    [0083] (ϋ/mg)
    [0084] 培養液 4.3xl03
    [0085] TSKgel CM-5PW 4.6xl04 11
    [0086] (最終精製物）
    [0087] *1) モノクローナル抗体 （SP- 322) を用いた EL1SA による T P A抗原量の定量を実施例 1に準じて行なつた。 実施例 3. 天然型 T P Aの精製
    [0088] 天然型 T P Aを含む培養液を実施例 2と同様にして、 硫酸化セ ルロファインを用いたァフィ二ティ クロマトグラフィー、 次いで TSKgel ETHER- 5PWを用いた疎水クロマトグラフィー、 次いで Pい SAX を用いた陰イオン交換クロマ トグラフィー、 さらに、 TSKgel CM- 5PW を用いた陽イオン交換クロマトグラフィ一にかけ、 活性各分の SDS-ポリアク リルァミ ドゲル電気泳動法および銀染色法によるバン ドの位置、 TM-EL1SA による抗原値、 さらにはフィプリ ン ァガロ ース平板法による活性値を指標にして天然型 T P Aを精製する。 天 然型 T P Aが高収率で得られ、 これを SDS-ポリアク リルアミ ドゲル 電気泳動および銀染色にかけると、 単一バンドとして検出される。 以下に具体例を述べる。 6
    [0089] 1) 硫酸化セルロフアインを用いたァフィ二ティ クロマトグラフィ 硫酸化セル口ファインゲル （生化学工業社製） をカラム （カラ ムサイズ 10ml ；直径 20mmの円筒型） に充填し、 これに溶液 1一 A
    [0090] [0.1 重量! ¾ Tween 80] を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH 6.0)を流速 3.3ml Z分で 100ml 通液し平衡化する。
    [0091] 天然型 TP A (Activase, Genentech 社製） 4mgZml濃度のも のを lmlと G I T培地 （和光純薬工業社製） 99mlを混合したもの を、 このカラムに通液する。 この後に上記溶液 1一 Aを 500ml 通 液し洗浄する。 次いで、 溶液 1一 B [1.0M塩化ナトリゥムおよび 0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0) を用い、 その活性画分を溶出させ、 各画分を SDS-ポリアタリルァミ ドゲル電気泳動および銀染色によるバン ドの位置、 TPA-ELISA に よる抗原値、 さらにはフイブリン ァガロース平板法による活性 値より、 その目的とする天然型 TP Aを含む分画 Umlを得る。
    [0092] 2) TSKgel ETHER- 5PWを用いた疎水クロマトグラフィー
    [0093] TSKgel ETHER-5PWゲルを充填したカラム （カラムサイズ ø 7.5 x 75腿；東ソ一社製） を島津製作所社製 H P L Cシステムに接続 したのち、 溶液 2— A [1.5M硫酸アンモニゥムを含む 0.1M酢酸ァ ンモニゥム緩衝液 （pH5.0)] を流速 2mlZ分で 30分間通液し平衡 化する。 前記 1)の硫酸化セルロフアインを用いたクロマトグラフ ィ一の溶出活性画分 13mlに、 26mlの溶液 2— Aを加え混ぜ合わし た後、 カラムに流速 2ml/分で吸着させる。
    [0094] 溶液 2— Aで同流速でさらに 20分間洗浄する。 溶液 2— Aと溶 液 2— B [0.1 重量％ Tween 80を含む β.1M酢酸アンモニゥム緩衝 液 （ρΗ5.0)とを用い、 流速 lnilZ分で 60分間の溶液 2— Βが 0〜 100%までのリ二アグラジヱントをかけ、 その活性画分を溶出さ せる。 SDS-ポリアク リルアミ ドゲル電気泳動および銀染色による バン ドの位置、 TPA-EL1SA による抗原値より、 その目的とする天 然型 TP Aを含む分画 11. を得る。
    [0095] 3) PL-SAXを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ一
    [0096] Pい SAXゲルを充填したカラム （カラムサイズ 04.6x 150麵 ； 20/im 1 QA ； POLYMER LABORATORIES社製） を島津製作所社 製 H P L Cシステムに接続したのち、 溶液 3— A [0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （ρΗδ.0)] を流速 1.0ml Z分で 30分間通液し平衡化する。 前記 2)の TSKgel ETHER - 5PW を用いたク口マトグラフィ一の溶出活性画分 11.5mlに、 l(Hm 1 の溶液 3— Aを加え混ぜ合わしたのち、 カラム流速 1.0ml/分で カラムに素通しさせた後、 さらに溶液 3— Aで洗浄後、 150ml の 溶出液を得る。 4) TSKgel CM-5PW を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー
    [0097] TSKgel CM- 5PW ゲルを充填したカラム （カラムサイズ 47.5x75 腿 ；東ソ一社製） を島津製作所社製 HP L Cシステムを用い、 溶 液 4一 A [0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝 液 （pH6.0)] を流速 2ral/分で吸着させる。 溶液 4一 Aで同流速 でさらに 10分間洗浄する。 溶液 4— Aと溶液 4— B [1.0M塩化ナ ト リ ウムおよび 0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム 緩衝液 （pH 6.0)] とを用い流速 lml/分で 60分間の溶液 4— B が O〜10Q %までのリニアグラジヱントをかけ、 その活性画分を 得る。 溶出活性画分を用い SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 および銀染色にかけ、 そのバンドの位置、 TPA- EL1SA (前記） に よる抗原値、 さらにはフイブリ ンプレー ト法 （前記） による活性 値より、 その目的とする天然型 T P Aを含む分画 Π.5 mlを得る。 この得られた分画を集め、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 および銀染色にかけると、 天然型 TP Aが単一バン ドとして検出 8
    [0098] される,
    [0099] 試料 天然型 TP A
    [0100] 抗原量 （ ) 回収率 （％)
    [0101] 培養液 3899 100
    [0102] TSKgel CM-5P 1616 41 実施例 5. 改良型 TP A [V I] の精製
    [0103] 硫酸化セル口ファインゲル （生化学工業社製） をカラム
    [0104] (Superf lo column ； カラムサイズ 50ml； Sepragen社製） に充填し、 東ソ一社製 H PL Cシステムを用いて、 これに 0.1 重量]) ί Tween 80 を含む 0.1M齚酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)を流速 15mlZ分で 30分 間通液し平衡化する。
    [0105] 改良型 TP A [V I] (国際公開第 89/03874号パンフレッ ト
    [0106] (1989)に記載されている） 培養液を pH6.0 に調整後、 このカラムに 通液する。 この後に上記緩衝液を通し同流速で十分に洗浄する。 次いで、 1. GM塩化ナトリゥムおよび 0.1 重量％ Twe 80を含む G.1M 酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)を用い、 同流速で溶出し、 溶出画 分を得る
    [0107] この改良型 TP A [V I] の回収率は約 90%であった。 料 改良型 TP A [V I] *2
    [0108] (ml) 抗原量 （/!g) 回収率 （％) 培養液 2000 492 100
    [0109] 溶出液' 3900 U 15
    [0110] 溶出液' 300 442 90
    [0111] 2) モノクローナル抗体 （SP- 322) 用いた EL1SA による TPA抗 原量の定量を実施例 1に準じて行な,つた。
    [0112] *3) 溶出液と洗浄液 *4) 1. QM塩化ナトリゥムおよび Q.1 重量％ Twe.en 80を含む Q.1M酢 酸アンモニゥム緩衝液 （PH6.0)による溶出液。 実施例 6. 天然型 TP Aの精製
    [0113] 天然型 TP Aを含む培養液を実施例 5と同様にして、 硫酸化セル 口ファインゲルを充填したカラムを用いて精製する。 この際も、 実 施例 5と同様に天然型 TP Aを高回収率で取得できる。 以下に具体 例を述べる。
    [0114] 硫酸化セル口ファインゲル （生化学工業社製） をカラム （カラム サイズ 10ml；直径 20腿の円筒型） に充填し、 これに溶液 1一 A
    [0115] [0.1 重量％ Tween 80を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0) を流速 3.3ml Z分で Oml 通液し平衡化する。
    [0116] 天然型 TPA (Act ivase, Genent eeh 社製) 4mg/ml濃度のもの を lmlと G I T培地 （和光純薬工業社製） 99mlを混合したものを、 このカラムに通液する。 この後に上記溶液 1一 Aを 500ml 通液し洗 浄する。 次いで、 溶液 1— B [1.0M塩化ナトリゥム及び 0.1 重量％ Tween80 を含む 0.1M酢酸アンモニゥム緩衝液 （pH6.0)] を用い、 そ の活性画分を溶出させ、 各画分を SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気 泳動および銀染色によるバン ドの位置、 TPA-EL1SA による抗原値、 さらにはフイブリン ァガロース平板法による活性値をもとに、 そ の目的とする天然型 T P Aを含む分画 13mlを得る。
    [0117] この天然型 T P Aの回収率は、 約 96%であった。 試料 天然型 TP A
    [0118] 活性値 （U) *5 回収率 （％)
    [0119] 出発材料 125260ΰ 100
    [0120] 溶出液 （13ml) 1208153 96.5
    [0121] *5) フイ ブリン Zァガロース平板法 （国際公開第 パンフ レッ ト （1989) に記載されている） による活性値
    权利要求:
    Claims
    請求の範囲 . 組織型プラスミノ一ゲンァクチべ一夕 （以下、 T P Aと略す） またはその誘導体含有液を最初にァフィ二ティ一クロマトグラフ ィー工程で処理し、 その後任意の順序で、 疎水クロマトグラフィ —工程、 陽イオン交換クロマトグラフィ一工程、 および必要によ り陰イオン交換クロマトグラフィ一工程により処理することを特 徵とする精製 T P Aまたはその誘導体の製造方法。
    . T P Aまたはその誘導体含有液を最初にァフィ二ティークロマ トグラフィー工程で処理し、 次いで疎水クロマトグラフィー工程 で処理し、 最後に陽イオン交換クロマトグラフィ一工程で処理す ることを特徵とする請求の範囲第 1項記載の製造方法。
    . T P Aまたはその誘導体含有液を最初にァフィ二ティークロマ トグラフィ一工程で処理し、 次いで疎水クロマトグラフィ一工程、 陰イオン交換クロマトグラブィ一工程で処理し、 最後に陽イオン 交換ク口マトグラフィ一工程により処理することからなる請求の 範囲第 1項記載の製造方法。
    . ァフィ二ティークロマトグラフィー工程が、 セルロース硫酸ェ ステルまたは架橋ポリサッカライ ド硫酸エステルを用いたァフィ 二ティ一クロマトグラフィ一工程であり、 疎水ク口マトグラフィ 一工程が、 オリゴエチレングリコール基を導入したゲルを用いた 疎水クロマトグラフィ一工程であり、 陽イオン交換クロマトグラ フィ一工程がカルボキシメチル基を導入したゲルを用いた陽ィォ ン交換クロマトグラフィ一工程であり、 陰イオン交換クロマトグ ラフィ ー工程が、 4級アミノエチル基を導入したゲルを用いた陰 イオン交換クロマトグラフィ一工程である請求の範囲第 1項また は第 3項記載の製造方法。
    . T P Aまたはその誘導体含有液を最初にセルロース硫酸エステ ルまたは架橋ポリサッカライ ド硫酸エステルを用いたァフィニテ 2 ィークロマトグラフィ一工程で処理し、 次いでォリゴエチレング リコール基を導入したゲルを用いた疎水クロマトグラフィ 工程 で処理し、 更に、 カルボキシメチル基を導入したゲルを用いた陽 イオン交換クロマトグラフィ一工程で処理することからなる請求 の範囲第 2項記載の製造方法。
    6 . 陽イオン交換クロマトグラフィー工程を 2回以上繰り返すこと からなる請求の範囲第 2項または第 5項記載の製造法。
    7 . T P Aまたはその誘導体含有液をクロマトグラフィ一ゲルとし てセルロース硫酸エステルまたは、 架橋ポリサッカライ ド硫酸ェ ステルのゲルで処理することを特徵とする精製 T P Aまたはその 誘導体の製造方法。
    8 . セルロース硫酸エステルが、 結晶セルロースまたは結晶領域お よび非結晶領域からなるセル口一スの硫酸エステル体である請求 の範囲第 4項、 5項または 7項のいずれかの項に記載の製造方法。 9 . 架橋ポリサッカライ ド硫酸エステルが架橋セルロース硫酸エス テル、 架橋ァガロース硫酸エステルおよび架橋デキストラン硫酸 エステルから選ばれる 1種である請求の範囲第 4項、 5項または 7項記載の製造方法。
    1 0. 架橋セルロース硫酸エステルがェピクロルヒ ドリ ン架橋セル口 ース硫酸エステルである請求の範囲第 9項記載の製造方法。
    1 1. 架橋ァガロース硫酸エステルがェピクロルヒ ドリ ン架橋ァガロ —ス硫酸エステルである請求の範囲第 9項記載の製造方法。
    1 2. クロマトグラフィ一法がカラムクロマトグラフィーまたはバッ チ法である請求の範囲第 7項記載の製造方法。
    1 3. 界面活性剤の存在下において実施することからなる請求の範囲 第 1項乃至 項のいずれかの項に記載の製造方法。
    1 4. 界面活性剤が 0. 0 1〜(！ . 5 重量％の ¥ 6 6 11 8 0である請求の範囲第 1 3項に記載の製造方法。
    1 5. T P Aまたはその誘導体含有液にセリ ンプロテアーゼィンヒビ ターを加えて実施することからなる請求の範囲第 1項乃至 14項の いずれかの項に記載の製造方法。
    16. T P Aまたはその誘導体含有液が真核生物細胞系の培養液から の上澄液である請求の範囲第 1項乃至 15項のいずれかの項に記載 の製造方法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1991-09-19| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1991-09-19| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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